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针对上述问题，四川大学程冲教授、马田研究员与丁兆越副研究员团队等，设计了一种层间钌配位全共轭COF人工抗氧化酶（TTf-Ru）。该体系顺利获得扩展的π电子离域与精准设计的不对称Ru-N₂Cl₂配位位点协同，创造了最优的电子环境用于ROS清除，展现出媲美天然酶的多重酶模拟活性（CAT、SOD、GPx），并能在炎症微环境中保护PDLSCs成骨分化能力、重编程巨噬细胞向修复表型极化，最终实现牙槽骨再生。该工作建立了COF基酶模拟物的新设计范式，为ROS介导的炎症性疾病治疗给予了精准氧化还原调控与免疫微环境工程相结合的新策略。该文章于2025年10月24日以《Covalent Organic Framework-Based Artificial Antioxidases with 𝝅-Electron Delocalization and Asymmetric Coordination Sites for Superior Inflammation Inhibition and Oral Bone Modulation》为题发表于《Advanced Materials》（DOI: 10.1002/adma.202514915）。

方案1. TTf-Ru人工抗氧化酶的仿生设计及其抑制炎症级联反应、调控骨稳态的功能示意图

（1）COF人工抗氧化酶的合成与结构表征

溶剂热聚合法合成全缩合框架TTf（等摩尔胺醛，邻二氯苯/正丁醇）与亚化学计量框架TTs（胺醛比1:2，1,4-二氧六环）。PXRD显示TTf层间距5.2 Å，TTs孔径增至20 Å；XPS显示TTf相对于TTs出现C 1s和N 1s结合能下移。TTf-Ru中Ru负载达8.12 wt.%，BET比表面积由828.317 m²·g⁻¹降至698.182 m²·g⁻¹，FTIR中亚胺C=N峰由1626 cm⁻¹红移至1605 cm⁻¹。SEM与HRTEM显示TTf-Ru呈粒径约150 nm的花瓣状纳米聚集体，EDX证实Ru原子级分散。XAS显示TTf-Ru平均氧化态+2.09，EXAFS拟合为Ru-N₂Cl₂不对称配位构型（Ru-N: 2.00/2.15 Å，Ru-Cl: 2.30 Å），区别于PPor-Ru的对称Ru-N₄构型（Ru-N: 2.20 Å）。

图1. TTf与TTf-Ru的结构表征。a）TTf与TTs的合成及结构示意图；b、c）TTf的结构模型与Pawley精修图谱；d、e）TTs的结构模型与Pawley精修图谱；f）TTf与TTs的高分辨C 1s XPS光谱；g）TTf与TTs的紫外-可见漫反射光谱；h）TTf与TTf-Ru的固体¹³C CP/MAS NMR光谱；i）TPE-4CHO、TPE-4NH₂、TTs、TTf及TTf-Ru的FTIR光谱；j）基于TEM图像的TTf-Ru形貌与粒径分布分析；k、l）TTf-Ru的HR-TEM图像及相应EDS元素mapping。

（2）TTf-Ru的多重酶模拟活性与催化机制

TTf-Ru具有广谱ROS清除能力。在KO₂-DMSO体系中，TTf-Ru 5 min内清除≈84%超氧阴离子，SOD样活性显著优于TTs-Ru和PPor-Ru；CAT样活性方面，TTf-Ru 2.5 min内分解>75% H₂O₂，10 min内几乎完全清除（>99%），仅30 μg·mL⁻¹即可消除>75% H₂O₂。动力学研究取得Vmax=121.4 μM·s⁻¹、Km=118.85 mM、TON=6.59 s⁻¹，超越大多数已报道的人工金属酶；3天内活性几乎不变。原位DRIFT与DFT计算揭示催化机制：H₂O₂引入后检测到吸附H₂O₂（≈3060 cm⁻¹）、OOH中间体（≈1325 cm⁻¹）、OH中间体（≈1034 cm⁻¹）及O₂相关峰（≈872 cm⁻¹），支持四步吸附演化机制。O₂脱附能计算显示TTf-Ru中Ru-N₂Cl₂构型的O₂吸附能（-0.68 eV）低于PPor-Ru中Ru-N₄构型（-1.57 eV），PDOS分析揭示Ru 4d与O 2p轨道重叠降低，dxz轨道呈现反键特征；完整催化路径计算证实O₂脱附为速率决定步骤，TTf-Ru的O₂释放能垒（0.55 eV）显著低于PPor-Ru（1.47 eV），解释了其优异的CAT样活性。

图2. TTf-Ru的化学组成与配位结构分析。a）TTf-Ru、b）TTs-Ru及c）PPor-Ru的结构示意图；d）XPS全谱；e）TTf与TTf-Ru的高分辨N 1s XPS光谱；f）TTf-Ru、Ru箔、RuCl₃及RuO₂的Ru K边XANES光谱及TTf-Ru中Ru平均氧化态评估；g）Ru K边FT-EXAFS光谱；h）TTf-Ru的EXAFS拟合曲线（实部与虚部）；i）Ru K边EXAFS小波变换；j）PPor-Ru的EXAFS拟合曲线（实部与虚部）。

图3. TTf-Ru的ROS消除性能与催化机制。a）TTf-Ru抗氧化活性示意图；b）SOD样、c）CAT样（H₂O₂消耗）及d）GPx样酶活性；e）TTf-Ru、TTs-Ru与PPor-Ru抗氧化活性比较雷达图；f）TTf-Ru与近期报道生物催化剂的Vmax和TON值比较；g）CAT样过程的原位FTIR光谱及相应等高线图；h）TTs-Ru与i）TTf-Ru的ESP分布图；j）TTf-Ru与PPor-Ru的O₂吸附能；k）RuN₂Cl₂位点与Ru-N₄位点上O₂*的电荷密度差及l）PDOS分析；m）RuN₂Cl₂位点与Ru-N₄位点氧释放步骤示意图。

（3）TTf-Ru的细胞水平ROS清除与生物相容性

TTf-Ru对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）、前成骨细胞MC3T3-E1和小鼠巨噬细胞Raw264.7具有良好的生物相容性与抗氧化保护效果。细胞毒性实验显示TTf-Ru对hPDLSCs和MC3T3-E1在≤25 μg·mL⁻¹浓度下无显著毒性，Raw264.7细胞耐受浓度达1 μg·mL⁻¹。100 μM H₂O₂处理1 h建立的氧化应激模型中，DCFH-DA探针定量显示25 μg·mL⁻¹ TTf-Ru使hPDLSCs和MC3T3-E1胞内ROS恢复至基线水平；细胞增殖实验显示TTf-Ru支持72 h持续增殖，活/死染色证实细胞活力与未处理对照相当。TEM成像证实hPDLSCs顺利获得内吞作用摄取TTf-Ru纳米颗粒，氧敏感荧光指示剂证实其可有效清除ROS并释放O₂。Calcein-AM/PI实验显示TTf-Ru使氧化应激下hPDLSCs活力由83%升至99%，MC3T3-E1由65%升至92%；鬼笔环肽染色显示TTf-Ru保护组维持正常铺展形态和完整肌动蛋白丝，划痕实验证实48 h内伤口闭合显著加速。LPS刺激的Raw264.7极化实验显示，TTf-Ru显著上调M2标志物CD206表达，同时显著降低M1标志物iNOS水平，表明其顺利获得直接细胞保护干细胞与创建促再生免疫微环境发挥双重作用。

图4. TTf-Ru的体外ROS清除与生物相容性。a）TTf-Ru清除胞内ROS并保护细胞的示意图；b–d）TTf-Ru孵育后hPDLSC、MC3T3-E1和Raw264.7的细胞活力（n=6）；e–g）hPDLSC、MC3T3-E1和Raw264.7的增殖实验；h）活/死双染荧光代表性图像及i–k）CCK-8定量分析（n=3）；l）TTf-Ru抗氧化酶ROS消除能力代表性图像；m–o）多细胞类型不同处理下DCFH-DA荧光测量分析（n=3）。

图5. TTf-Ru在高ROS环境下保护细胞功能。a）氧化应激环境下人工抗氧化酶保护能力的活/死双染荧光评估及b–c）定量分析（n=3）；d）鬼笔环肽F-actin染色观察细胞形态及e–f）相应定量分析（n=3）；g）hPDLSC和MC3T3-E1划痕实验代表性图像；h–i）hPDLSC和MC3T3-E1相对铺展面积（n=3）；j–k）CD206（M2）和iNOS（M1）巨噬细胞标记半定量分析（n=4）；l）评估巨噬细胞极化的CD206和iNOS代表性荧光图像；m）TTf-Ru对干细胞保护及巨噬细胞抗炎效应示意图。

（4）TTf-Ru维持氧化应激下的干细胞成骨分化能力

TTf-Ru在氧化应激条件下维持hPDLSCs成骨分化能力。ALP活性测定显示TTf-Ru处理组第7天早期成骨潜能与未应激对照相当，第21天茜素红S染色显示矿化结节形成完整。RT-qPCR显示TTf-Ru显著上调Alp、Runx2、Bmp2、Opn、Bsp和Col1表达，免疫荧光分析证实BMP2-Runx2信号通路表达强度与未应激对照相当。转录组测序（RNA-seq）主成分分析显示处理组间明显聚类，差异表达分析鉴定TTf-Ru+H₂O₂组相比H₂O₂组有715个上调和758个下调基因。GO富集分析显示显著参与应激反应、肌动蛋白骨架介导的细胞运动与迁移、骨稳态等生物学过程；KEGG通路分析显示TTf-Ru调控TNF、NF-κB、IL-17等关键炎症信号通路，以及黏着斑、破骨细胞分化和PI3K-Akt信号轴。基因集富集分析显示TTf-Ru组显著富集黏着斑通路和PDGF信号通路（顺利获得PI3K-Akt-mTOR轴促进细胞增殖、迁移和存活），而单独H₂O₂处理组显示细胞色素P450和氧化磷酸化通路活性升高。

图6. TTf-Ru在高氧化应激下维持细胞成骨分化。a）TTf-Ru对细胞成骨分化影响的示意图；b）hPDLSC成骨分化后ALP染色代表性图像；c）hPDLSC ALP染色定量分析；d）MC3T3-E1茜素红S染色定量分析；e）MC3T3-E1成骨分化后茜素红S染色代表性图像；f–k）成骨诱导7天后hPDLSC（Alp、Runx2、Bmp2）和MC3T3-E1（Bsp、Opn、Col1）的RT-qPCR mRNA表达测量（n=3）；l–o）hPDLSC和MC3T3-E1中Bmp2（红色）和Runx2（绿色）相对平均荧光强度半定量分析；p–q）成骨分化后hPDLSC和MC3T3-E1中Bmp2（红色）和Runx2（绿色）的免疫荧光图像。

图7. 高ROS水平微环境下hPDLSCs的RNA测序分析。a）TTf-Ru与对照（PBS）组的PCA分析；b）TTf-Ru与H₂O₂组所有基因表达的火山图；c）不同处理后hPDLSCs差异表达热图；d）H₂O₂ vs TTf-Ru+H₂O₂组的GO富集分析；e）H₂O₂ vs TTf-Ru+H₂O₂组的KEGG通路富集分析；f、g）TTf-Ru+H₂O₂与H₂O₂组间PDGF通路和黏着斑的GSEA分析；h、i）TTf-Ru+H₂O₂与H₂O₂组间细胞色素P450和氧化磷酸化的GSEA分析；j）氧化应激下hPDLSC产生炎症和骨吸收的信号通路示意图。

（5）TTf-Ru在牙周炎模型中的体内治疗效果与生物安全性

Micro-CT分析显示TTf-Ru显著降低牙周炎小鼠釉牙骨质界-牙槽嵴顶距离（CEJ-ABC）并改善骨体积分数（BV/TV），骨小梁参数（厚度、数量、分离度）保持与健康组织无差异的水平。H&E染色显示TTf-Ru处理组牙周结构完整、牙槽骨高度恢复；Masson三色染色显示胶原纤维网络排列良好。TRAP染色显示破骨细胞活性显著降低；免疫荧光显示成骨标志物Bmp2和Runx2表达增强，同时巨噬细胞极化从促炎iNOS（M1标志）向修复性CD206（M2标志）转变。免疫荧光显示TTf-Ru处理显著减弱核p-p65信号，证实其顺利获得抑制NF-κB和IL-17信号级联改善炎症反应。生物安全性评估显示：TTf-Ru在生理介质中7天内分散良好，Ru离子释放量极低；治疗浓度1 mg·mL⁻¹下溶血率<2%；主要器官组织病理学检查未见治疗相关异常；血液学和生化分析指标均在生理范围内。

图8. TTf-Ru促进体内牙槽骨恢复。a）体内研究设计流程图；b）TTf-Ru免疫调节与骨重塑示意图；c–d）各组牙槽骨形态学参数定量分析（包括远中颊根CEJ-ABC距离（n=5）、BV/TV（n=5））；e）各组牙槽骨三维重建代表性图像；f）治疗后各实验组H&E染色图像（MR：第二磨牙近中根，DR：第二磨牙远中根，AB：牙槽骨，PDL：牙周膜）；g）Masson三色染色（M1：上颌第一磨牙，M2：上颌第二磨牙，AB：牙槽骨）；h）上颌第二磨牙周围区域TRAP阳性细胞检测；i）TRAP染色定量分析（n=3）；j–k）Bmp2和Runx2标记平均荧光强度半定量分析（n=4）；l）Bmp2和Runx2代表性免疫荧光染色；m–n）CD206和iNOS标记平均荧光强度半定量分析（n=4）；o）CD206和iNOS代表性免疫荧光共染色。