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图1. 仿生机械定制微球用于功能性肝修复的示意图。（A）顺利获得微流控装置制备三种仿生机械定制dECM-Alg IPN水凝胶微球。（B）快速水凝胶微球顺利获得抑制F-actin/ROCK/YAP通路的异常激活促进功能性HLCs生成。（C）机械定制微球-HLCs对ALF的治疗作用。

（1）ALF改变肝脏粘弹性并激活机械信号通路

顺利获得建立CCl₄诱导的ALF小鼠模型，检测了造模后12 h、24 h和120 h肝脏机械特性的时序演变。大体观察显示ALF肝脏呈灰白色，质地明显改变，24 h时最为显著。压缩测试和流变剪切松弛测试表明，健康肝脏比ALF肝脏更快耗散应力，ALF肝脏表现出延长的应力松弛半衰期（τ₁/₂）和更高的残余应力，提示应力松弛减慢。储能模量（G′）和损耗模量（G″）在ALF肝脏中均升高，但损耗正切（tanδ）降低，表明肝脏从健康的快速能量耗散粘弹性固体向更具弹性、机械迟缓的病理组织转变，该变化在24 h达峰。RNA测序基因集富集分析（GSEA）显示，ALF肝脏中细胞-ECM相互作用（肌动蛋白细胞骨架调控、黏着斑等）、Rho GTP酶和Hippo信号通路显著上调，而肝脏代谢功能基因下调。这些结果表明ALF病理机械微环境与肝细胞功能障碍和再生受损密切相关。

图2. ALF改变肝脏粘弹性及机械信号通路。（A-B）健康（A）和ALF（B，诱导后24 h）小鼠肝脏代表性图像。（C）新鲜肝脏压缩测试示意图。（D）压缩测试取得的应力松弛曲线。（E）压缩测试中应力松弛至初始值一半所需时间（τ₁/₂）的定量分析（n=10）。（F）压缩测试中60 s时应力松弛百分比（n=10）。（G）新鲜肝脏流变分析示意图。（H）流变分析中的应力松弛曲线。（I）流变分析中τ₁/₂的定量分析（n=10）。（J）剪切流变时间扫描曲线。（K）剪切流变损耗模量（G″）（n=10）。（L）剪切流变损耗正切（n=10）。（M）储能模量（G′）和损耗模量（G″）百分比图。（N）ALF与健康肝脏RNA-seq的GSEA分析（P<0.05且|NES|>1）。（O）核心机械敏感基因表达热图。统计学分析采用单因素方差分析。数据以平均值±SD表示。

（2）仿生机械定制微球的设计与制备

基于上述发现，利用微流控平台设计并制备了三种具有不同粘弹性特征的dECM-Alg IPN水凝胶微球。顺利获得调节海藻酸钠分子量和交联钙离子浓度，在保持相似生理刚度（杨氏模量和储能模量与健康小鼠肝脏相当）的前提下，实现了对应力松弛动力学的解耦调控。其中，"Fast"微球模拟健康肝脏的快速应力松弛，"Slow"微球模拟ALF肝脏的缓慢松弛，"Elastic"微球则表现为弱弹性固体、粘弹性超出生理范围。有限元模拟显示，Fast微球在压缩方向发生明显形变，能有效缓解应力；而Slow和Elastic微球出现显著应力集中。微球直径约220 μm，呈均匀多孔结构。hADSCs与微球共培养后，活/死染色和CCK-8证实细胞在dECM-Alg IPN水凝胶微球上存活良好、粘附铺展，且初始细胞负载率在各组间无显著差异。

图3. 机械定制微球的设计与制备。（A）顺利获得微流控技术调节海藻酸钠分子量和钙离子浓度制备三种不同粘弹性dECM-Alg IPN水凝胶微球的示意图。（B）健康小鼠肝脏与微球的杨氏模量（n=3）。（C）压缩测试取得的应力松弛曲线（n=3）。（D）压缩测试中τ₁/₂的定量分析（n=3）。（E）压缩测试中60 s时应力松弛百分比（n=3）。（F）流变分析中的应力松弛曲线（n=3）。（G）流变分析中τ₁/₂的定量分析（n=3）。（H）剪切流变储能模量（n=3）。（I）剪切流变损耗正切（n=3）。（J）微球表面应力和形变的数值模拟。（K）细胞负载至微球的示意图。（L）水凝胶微球的尺寸分布（n≥108）。（M）hADSCs与水凝胶微球共培养3天的细胞活力（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析。数据以平均值±SD表示。ns表示无显著性差异。

（3）快速松弛微球促进功能性HLCs生成

采用23天标准化分化方案评估不同粘弹性微球对hADSCs向HLCs分化的影响。结果显示，Fast微球中生成的HLCs（Fast-HLCs）肝脏特异性基因表达显著高于Slow-HLCs和Elastic-HLCs。例如，肝细胞身份主调控因子HNF4A在Fast-HLCs中较Slow-HLCs上调2.7倍，较Elastic-HLCs上调5.5倍；合成标志物ALB和结构蛋白CK18表达达到人永生化肝细胞THLE-2参考水平；A1AT甚至超过THLE-2水平；药物代谢关键酶CYP3A4也显著升高。免疫荧光和定量分析显示Fast-HLCs中HNF4α和ALB荧光信号最强。功能学检测表明，Fast-HLCs在利福平诱导下表现出最高的CYP3A4酶活性，并分泌更多ALB、尿素、A1AT和VII因子，证明其具有更优的合成和代谢肝功能。

图4. 快速水凝胶微球促进功能性HLCs生成。（A）hADSCs负载微球向HLCs分化的示意图。（B）肝分化后HLCs负载微球中肝脏特异性基因的相对mRNA表达（n=3）。（C）HNF4α和ALB代表性免疫荧光图像。（D）（C）中对应的定量分析。（E）P450-Glo法检测CYP3A4酶活性（n=3）。（F-I）培养上清中ALB、尿素、A1AT和VII因子的分泌水平（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析。数据以平均值±SD表示。

（4）粘弹性顺利获得F-actin/ROCK/YAP通路调控肝分化

图5. 粘弹性顺利获得F-actin/ROCK/YAP通路调控肝分化。（A）F-actin聚合的代表性共聚焦免疫荧光图像及伪彩图。（B）基于F-actin染色图像的取向角频率分布。（C）形成应力纤维的细胞百分比定量（n=3）。（D）YAP定位的代表性共聚焦免疫荧光图像。（E）YAP核质荧光强度比定量（n=10）。（F）p-MYPT1、MYPT1、p-MLC和MLC表达水平的Western blot。（G）ELISA试剂盒检测ROCK活性（n=3）。（H-I）添加YAP抑制剂Verteporfin（Vp）（H）或ROCK抑制剂Y-27632（Y27）（I）后HLCs负载微球中肝脏相关基因HNF4A和ALB的相对mRNA表达（n=3）。（J）不同粘弹性微球诱导hADSCs分化过程中机械信号转导示意图。统计学分析在（C、E、G）中采用单因素方差分析，在（H、I）中采用双因素方差分析。数据以平均值±SD表示。

（5）机械定制微球-HLCs在CCl₄诱导ALF模型中的治疗效果

将不同粘弹性微球-HLCs顺利获得Janus HA-PAMN组织贴片移植至CCl₄诱导ALF小鼠肝脏表面。生化检测显示，ALF小鼠血清AST和ALT急剧升高，而各治疗组均显著降低，Fast-HLCs组降幅最显著。H&E染色显示Fast-HLCs组肝组织坏死面积远小于未治疗ALF组。TUNEL染色表明Fast-HLCs组凋亡细胞死亡显著减少，Ki67免疫荧光显示该组增殖细胞数量最多。肝功基因Hnf4a、Cyp3a11和Cyp1a2在Fast-HLCs组恢复最显著，分别较假手术组提高3.3倍、2.3倍和2.8倍，接近正常水平。血清人源ALB检测显示Fast-HLCs组水平显著高于其他移植组。氧化应激指标MDA、•O₂⁻和H₂O₂在Fast-HLCs组显著降低，抗氧化基因Nqo1、Ho1和Gpx1表达最高。抗炎基因Il10和Arg1显著上调，促炎基因Tnf、Nos2和Nlrp3显著下调，TNFα和NOS2免疫荧光证实促炎信号在Fast-HLCs组被显著抑制。

图6. 机械定制微球-HLCs对CCl₄诱导ALF的治疗效果。（A）CCl₄诱导小鼠ALF模型构建及治疗流程示意图。（B）血清ALT和AST水平（n=5）。（C）H&E染色肝切片代表性图像及肝坏死面积定量分析（n=10）。（D-E）TUNEL染色肝切片代表性图像及TUNEL阳性细胞定量分析（n=10）。（F-G）Ki67染色肝切片代表性图像及Ki67阳性细胞定量分析（n=10）。（H）肝组织中肝功能相关基因（Hnf4a、Cyp3a11、Cyp1a2）的相对mRNA表达（n=5）。（I-K）肝内氧化应激标志物MDA（I）、•O₂⁻（J）和H₂O₂（K）水平（n=5）。（L）抗氧化酶相关基因（Nqo1、Ho1、Gpx1）的相对mRNA表达（n=5）。（M）抗炎相关基因（Il10、Arg1）的相对mRNA表达（n=5）。（N）促炎相关基因（Tnf、Nos2、Nlrp3）的相对mRNA表达（n=5）。（O）肝切片NOS2免疫荧光染色及定量分析（n=10）。（P）肝切片TNFα免疫荧光染色及定量分析（n=10）。统计学分析采用单因素方差分析。数据以平均值±SD表示。

（6）转录组分析揭示治疗机制

为深入探究治疗机制，对健康对照、ALF和Fast-HLCs治疗组肝组织进行了RNA测序。主成分分析（PCA）显示三组转录组明显分离。与ALF组相比，Fast-HLCs治疗后1648个基因下调、1483个基因上调。KEGG富集分析显示治疗影响多条ALF病理和恢复相关通路。GO分析揭示凋亡过程、炎症反应、脂质代谢、肌动蛋白细胞骨架组织等显著富集。GSEA显示Fast-HLCs治疗显著抑制细胞死亡（凋亡、坏死、p53信号）和疾病相关机械转导通路（细胞-ECM相互作用、Rho GTP酶、肌动蛋白细胞骨架调控），同时上调肝功能（胆汁分泌、细胞色素P450药物代谢）和抗氧化通路（谷胱甘肽代谢）。热图显示Fast-HLCs治疗上调肝脏代谢功能关键基因，下调损伤、炎症、氧化应激和纤维化相关基因。此外，治疗组肝脏宏观力学特性（压缩和流变测试）也显著区别于ALF组，趋向健康肝脏特征。

图7. 转录组分析。（A）PC1和PC3的主成分分析（PCA）图。（B）样本组间基因数量和交集的UpSet图。（C）治疗组与ALF组差异表达基因（DEGs）的火山图。（D）治疗组与ALF组的KEGG通路富集分析。（E）KEGG通路的弦图分类分析。（F）治疗组与ALF组DEGs的基因本体（GO）富集分析。（G-J）治疗组与ALF组间细胞死亡（G）、肝功能（H）、细胞-ECM相互作用（I）和Rho GTPase（J）的GSEA谱（|NES|>1，P<0.05）。（K）差异表达基因热图。（L）ALF和治疗组肝脏压缩测试中τ₁/₂和60 s时应力松弛百分比（n=5）。（M）ALF和治疗组肝脏流变分析中τ₁/₂和60 s时应力松弛百分比（n=5）。（N）ALF和治疗组肝脏剪切流变损耗模量（G″）和损耗正切（n=5）。统计学分析采用双尾Student t检验。数据以平均值±SD表示。

（7）机械定制微球-HLCs促进肝切除术后肝脏再生

进一步在70%肝切除（PHx）诱导的ALF模型中评估策略。生存分析显示Fast和Slow微球-HLCs均提高PHx小鼠存活率。术后第2天，Fast-HLCs组肝/体重比显著高于假手术组（1.4倍），血清ALT、AST和总胆红素（TBiL）显著降低，ALB水平更高。H&E染色显示Fast-HLCs组有丝分裂象和双核肝细胞频率更高，炎症浸润减少。增殖基因Mki67、Pcna和Ccnd1在Fast-HLCs组最显著上调，Ki67免疫荧光证实其肝细胞增殖最强。CD31免疫荧光显示Fast-HLCs组再生过程中形成更粗的血管。成熟肝细胞标志物Cyp3a11、Cyp1a2和Glul在Fast-HLCs组恢复至接近健康对照水平，而早期肝细胞标志物Afp显著低于假手术组，提示再生肝细胞更快成熟。血清人ALB检测显示Fast-HLCs组水平最高。

图8. 机械定制微球-HLCs促进肝切除术后肝脏再生。（A）PHx诱导小鼠ALF模型构建及治疗流程示意图。（B）PHx诱导ALF小鼠生存曲线。（C）术后第2天各组肝脏大体形态。（D）术后第2天肝/体重比（n=5）。（E）术后第2天血清AST、ALT、TBiL和ALB水平（n=5）。（F）术后第2天H&E染色肝切片代表性图像。（G）术后第2天肝组织中细胞增殖相关基因（Mki67、Pcna、Ccnd1）的相对mRNA表达（n=5）。（H）术后第2天Ki67染色肝切片代表性图像及Ki67阳性肝细胞定量分析（n=9）。（I）术后第2天肝组织CD31免疫荧光染色。（J）术后第2天成熟肝细胞相关基因（Cyp3a11、Cyp1a2、Glul）的相对mRNA表达（n=5）。（K）术后第2天早期肝细胞标志物基因（Afp）的相对mRNA表达（n=5）。（L）PHx诱导ALF模型移植后2天受体小鼠血清人ALB水平（n=5）。统计学分析采用单因素方差分析。数据以平均值±SD表示。

（8）机械定制微球-HLCs在肝切除术模型中的抗炎与长期疗效

还评估了PHx后的氧化应激、炎症反应及长期再生能力。术后第2天，Fast-HLCs组肝组织•O₂⁻和H₂O₂水平显著低于假手术组，抗氧化基因Nqo1、Ho1和Gpx1明显上调。抗炎标志物Il10和Arg1在Fast-HLCs组最强上调，促炎标志物Tnf、Nos2和Nlrp3显著下调，TNFα免疫荧光证实炎症缓解。值得注意的是，Fast-HLCs组在再生启动阶段维持了足够触发再生的TNF-α水平，而在48 h时有效抑制了过度持续的炎症信号，实现了再生启动与抗炎调控的协调平衡。术后第7天，虽然假手术组血清AST和ALT已自然下降至与Fast-HLCs组相当，但Fast-HLCs组ALB水平显著更高；H&E显示治疗组细胞围绕中央静脉呈放射状排列，结构保存良好，类似健康肝脏形态。Ki67染色显示Fast-HLCs组在第7天仍维持更高增殖活性，且血清人ALB仍可被检测到，证明疗效可持续至少7天。

图9. 机械定制微球-HLCs在肝切除术诱导ALF中的抗炎与长期疗效。（A-B）术后第2天肝组织•O₂⁻（A）和H₂O₂（B）水平（n=5）。（C）术后第2天抗氧化酶相关基因（Nqo1、Ho1、Gpx1）的相对mRNA表达（n=5）。（D）术后第2天抗炎相关基因（Il10、Arg1）的相对mRNA表达（n=5）。（E）术后第2天促炎相关基因（Tnf、Nos2、Nlrp3）的相对mRNA表达（n=5）。（F）术后第2天肝切片TNFα免疫荧光染色及定量分析（n=9）。（G）术后第7天血清ALB、AST和ALT水平（n=3）。（H）术后第7天H&E染色肝切片代表性图像。（I）术后第7天肝切片Ki67免疫荧光染色及定量分析（n=9）。（J）PHx诱导ALF模型FS-HLCs移植后7天受体小鼠血清人ALB水平（n=3）。统计学分析在（A-F、I）中采用单因素方差分析，在（G）中采用双尾Student t检验。数据以平均值±SD表示。