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图1. 用于心肌梗死治疗的可注射、自愈合及诊疗一体化BSA水凝胶，负载线粒体靶向SOD-CAT级联纳米凝胶。

（1）BST水凝胶的合成与表征

CSDT纳米凝胶顺利获得2-DM修饰酶表面双键，并与丙烯酰胺及烯丙基三苯基溴化膦原位自由基聚合制备，呈球形，水合粒径约240 nm（图2a,b）。荧光共定位显示CAT与SOD可有效负载于同一纳米颗粒（图2c）。BSA蛋白水凝胶顺利获得BSA氨基与戊二醛的席夫碱反应制备，0.5%戊二醛条件下15%、20%及30% BSA溶液的凝胶时间分别为10、60和120 s（图2d,）；SEM显示水凝胶具有多孔结构，孔径50–100 µm（图2e）。拉伸测试表明水凝胶可拉伸至原长3–6倍，20% BSA水凝胶拉伸性能最优（图2f）。综合凝胶时间、可注射性、力学性能及心脏生理压力范围，选择20% BSA水凝胶进行后续研究。该水凝胶在纸杯、橡胶、塑料、玻璃及皮肤等多种基材上表现良好粘附性（图2g），并具备优异拉伸性与弹性恢复（图2h）。阶梯应变测试（1%与300%交替切换）证实该水凝胶在三个循环内均可实现可逆的破坏-恢复（图3a）。图3b显示切割后10分钟水凝胶完成自修复并保持拉伸性能，其机制为席夫碱键中醛基与氨基的动态交换（图3c）；该水凝胶同时表现弹性、可塑性和可注射性（图3d–f）。在抗氧化性能方面，负载CSDT的水凝胶（BST）可有效清除H₂O₂和·O₂⁻（图3g、h）；在DPPH·、·OH和ABTS·⁺自由基模型中，BSA水凝胶具有内在自由基清除活性，CSDT纳米凝胶显著增强其抗氧化性能（图3i–k）。

图2. BST水凝胶的特性：(a) 透射电镜图像，(b) 辐射光散射（DLS）分析，(c) CSDT的荧光共定位分析；(d) 胶化前后不同比例BSA的图片；(e) 胶化后不同比例BSA的扫描电子显微镜图像；(f) BSA水凝胶的拉伸性能；(g) BSA蛋白胶与不同物体的附着情况；(h) BSA水凝胶的拉伸图像。

图3. BST水凝胶的力学性能及其清除自由基能力。(a) 20% BSA蛋白水凝胶在1 Hz频率下进行三周期循环，应变从1%到300%的流变特性。(b) BSA水凝胶的自愈能力；(c) BSA水凝胶自愈机制示意图；(d) BSA水凝胶的可塑性；(e) 弹性；(f) 注射性；(g) 含不同天然酶纳米凝胶的BSA水凝胶对（g）H₂O₂、（h）⋅O₂⁻、(i)DPPH·、（j）⋅OH和(k)ABTS·+的清除能力。

（2）BST水凝胶的体外抗氧化及产氧特性

BST对H9C2心肌细胞和HUVEC人脐静脉内皮细胞具有良好的生物相容性，CSDT浓度在20 µg/mL内可促进细胞增殖且未诱导明显凋亡（图4a-c）。含TPP的CSDT较不含TPP的CSD表现出更优的线粒体靶向能力（图4d），可有效清除细胞及线粒体内过量ROS并将其转化为治疗性O₂（图4e），同时防止ROS损伤导致的线粒体膜电位下降（图4g），促进HUVEC细胞管腔形成（图4h）。

图4. BST水凝胶在体外对细胞的保护作。(a) BST水凝胶对H9C2细胞和(b) HUVEC细胞的细胞毒性（n = 5）。(c) 使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，顺利获得流式细胞术检测不同天然酶纳米凝胶负载BSA蛋白水凝胶处理后H9C2细胞的细胞毒性；(d) FITC标记纳米凝胶处理8小时后H9C2细胞的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）及2.5D图像。线粒体用MitoTracker Red染色（红色荧光），细胞核用DAPI染色（蓝色荧光），纳米凝胶用绿色荧光。比例尺：40 µm；(e) 使用DCFH-DA探针检测CSDT纳米凝胶和H2O2处理后H9C2细胞的ROS染色的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）及2.5D图像，红色荧光代表线粒体，绿色荧光代表ROS；(f) 使用Ru(dpp)3]Cl2探针检测BST和H2O2处理后H9C2细胞的O2染色的荧光图像；(g) 将H9C2细胞与不同天然酶纳米胶囊负载的BSA蛋白水凝胶共同孵育后，使用JC-1探针顺利获得流式细胞术分析H9C2细胞的线粒体损伤情况。(h) HUVEC细胞与负载不同天然酶纳米凝胶的BSA蛋白水凝胶共孵育后，HUVEC细胞管状化行为的荧光图像。

（3）BST水凝胶的免疫调节和抗炎作用

心肌梗死后炎症反应中，巨噬细胞M1/M2表型失衡是驱动组织损伤和重塑的关键因素，而ROS升高与缺氧加剧被认为是导致该极化失衡的重要病理机制。在LPS诱导的体外炎症模型中，BST处理可显著降低促炎M1型巨噬细胞（CD86+）比例，同时增加抗炎M2型巨噬细胞（CD206+）比例（图5a-c）；免疫荧光染色进一步显示，BST处理后巨噬细胞INOS表达显著下调，ARG-1表达显著上调（图5d-g）。与此一致，BST处理后巨噬细胞分泌的促炎因子TNF-α和IL-6水平显著降低，而抗炎因子IL-10和TGF-β水平显著升高（图5h-k）。上述结果提示BST可顺利获得降低ROS和缺氧相关促炎信号，在体外环境中再平衡巨噬细胞极化并调控炎症因子分泌。然而，M1/M2表型分类仅为简化模型，巨噬细胞激活具有高度情境依赖性；且LPS诱导的急性内毒素炎症模型无法完全模拟心肌梗死后无菌、时序动态及多细胞参与的复杂炎症微环境，因此BST的体内抗炎和免疫调节功能仍需进一步验证。

图5. BST的免疫调节作用。（a）载不同天然酶纳米凝胶的BSA蛋白水凝胶对巨噬细胞表型的流式分析；（b-c）M1（CD86+）和M2（CD206+）巨噬细胞表型的定量分析（n=3）；（d-e）M1（INOS）和M2（ARG-1）巨噬细胞表型的免疫荧光染色分析；（f-g）图d和e的免疫荧光半定量分析（n=3）；（h~k）巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β释放水平（n=3）。

（4）基于BST水凝胶的多功能心脏生物成像

BST蛋白水凝胶的体内示踪与降解行为分析如下。在成像功能构建方面，利用BSA分子表面丰富的游离氨基，顺利获得酰胺化反应分别将MRI造影剂4-Carboxy-TEMPO和CT造影剂Sodium diatrizoate共价接枝于BSA骨架，制备功能化衍生物BSA-TEMPO和BSA-SD，再经席夫碱交联反应构建BSTG蛋白水凝胶，赋予其MRI/CT双模态成像能力（图6a）。成像性能验证显示，与未修饰的BSA水凝胶相比，BSTG原位心肌注射后心脏区域MRI信号显著增强，T1加权信号强度提升约8倍（图6b-c,）；同步CT成像亦显示BSTG可有效增强心肌组织CT信号，信号强度约为BSA水凝胶的2.5倍（图6d-e），表明该双模态造影策略可实现对水凝胶在梗死区域分布的高灵敏度可视化监测。在降解动力学方面，顺利获得罗丹明B荧光标记追踪BST水凝胶在体内的滞留与降解过程，结果显示原位注射后荧光强度随时间逐渐衰减：3天内荧光信号急剧下降，提示水凝胶开始快速降解；14天内仍可检测到明显荧光信号，说明水凝胶在关键修复窗口期持续存在；至21天荧光完全消失，表明水凝胶完成彻底降解（图6f-g）。该降解时程与急性心肌梗死后组织重建的三阶段病理进程高度匹配-炎症期（0-3天）、增殖修复期（7-10天）及成熟重塑期（>14天），尤其在决定瘢痕质量和心室重塑程度的关键修复窗口（约第7天）内保持有效滞留，既有利于对梗死后微环境的持续调控，又具备良好的生物可降解性，避免了长期异物残留带来的潜在风险。

图6. 基于BSA水凝胶的诊疗平台。（a）BSTG蛋白水凝胶的制备示意图；（b）注射前后心肌MRI图像；（c）BSTG的T1弛豫率（n=3）；（d）注射前后心肌CT图像；（e）CT图像灰度定量分析（n=3）；（f）原位心肌注射后RhB标记BST水凝胶的体内分布；（g）心脏内荧光强度随时间变化的定量分析（n=3）。

（5）BST水凝胶对心肌梗死的体外治疗效果

实验建立小鼠LAD结扎心肌梗死模型并原位注射BST水凝胶进行治疗（图7a）。超声心动图显示，MI组LVEF较Sham组显著降低；7天时BSA和BSD处理未显著逆转LVEF下降，而BSC和BST处理可显著提高LVEF；至28天，BST组LVEF恢复最为显著（图7b-d）。生存曲线显示BST组28天存活率达100%（图7e）。Masson染色显示BST组心脏纤维化程度减轻，左心室壁厚度增加，效果优于BSC和BSD（图7f）。7天ROS染色显示BST组心肌ROS清除效果最佳（图7g-h），同时SOD-CAT酶级联反应将ROS转化为治疗性O₂，降低HIF-1α表达以缓解组织缺氧（图7i-j）。28天后BST处理有效降并促进CD31的表达以利于血管生成（图7k-l）。

图7. BST蛋白水凝胶对急性心肌梗死的治疗效果。（a）AMI模型建立及BST水凝胶给药示意图；（b）第28天超声心动图代表性图像；（c-d）治疗后28天心脏缩短分数和射血分数（n=5）；（e）治疗后28天生存曲线；（f）治疗后28天心脏Masson染色；（g-h）治疗后7天心脏ROS含量及半定量分析（n=3）；（i-j）治疗后7天心脏HIF-1α含量及半定量分析（n=3）；（k-l）治疗后28天心脏CD31免疫荧光染色及半定量分析（n=3）。

（6）BST水凝胶促进心肌梗死组织修复的机制

BST与MI组的RNA-seq主成分分析显示两组样本存在明显分离，共鉴定出432个差异表达基因，其中283个上调、149个下调（图8a）；层次聚类分析进一步证实BST处理可逆转MI诱导的大部分基因表达变化（图8b）。GO富集分析显示，这些差异基因在生物学过程层面主要集中于趋化因子介导的趋化作用和细胞因子介导的信号传导，在分子功能层面主要涉及细胞因子活性及免疫受体活性，在细胞组分层面则主要与胶原富集的细胞外基质和分泌颗粒相关（图8c）。KEGG通路分析进一步揭示，BST处理与MI组相比，在细胞因子-细胞因子受体相互作用、自噬以及炎症信号通路中存在显著富集（图8d）。从机制层面分析，上述转录组变化与BST的SOD-CAT酶级联功能密切相关：BST顺利获得将·O₂⁻和H₂O₂转化为O₂，有效减弱了ROS驱动的损伤相关分子模式释放，进而抑制下游促炎M1巨噬细胞的募集；RNA-seq数据中M1相关转录本的下调及M2标志物（如IL-10、TGF-β）的上调，共同反映了BST的免疫调控作用。此外，氧合水平的改善可能顺利获得激活内皮细胞STAT3磷酸化，促进其与Vegfa、Mmp2和Pdgfb等基因启动子的结合，从而上调血管生成相关通路，这与功能学血管生成实验结果一致。综合上述数据，BST顺利获得清除ROS、促进巨噬细胞向抗炎M2表型重编程以及激活血管新生基因程序，重塑缺血微环境，进而促进有效的心肌修复。

图8. BST治疗后心肌梗死组织的RNA测序分析。（a）差异表达基因火山图；（b）差异表达基因层次聚类热图（H：BST组，M：MI组；n=3）；（c）GO富集分析；（d）KEGG通路富集分析。